Аеробний біогенез наночастинок селену ентеробактерними клоаками z0206 в результаті

предметів

реферат

У цьому дослідженні ми дослідили здатність Enterobacter cloacae Z0206 зменшувати токсичний селеніт натрію та механізм цього процесу. Було встановлено, що E. cloacae Z0206 повністю відновлює до 10 мМ селеніту до елементарного селену (Se °) та утворює наночастинки селену (SeNP) в аеробних умовах. Ефектор, що відновлює селеніт клітини E. cloacae Z0206, повинен бути локалізованим у мембрані ферментом. Аналіз протеомів iTRAQ показав, що селеніт викликав значне збільшення експресії фумаратредуктази. Крім того, як додавання фумарату в бульйон, так і вимкнення фумаратредуктази (frd) значно зменшили швидкість скорочення селеніту, виявивши раніше невизнану роль фумаратредуктази E. cloacae Z0206 у зменшенні селеніту. На відміну від цього, реакції, опосередковані глутатіоном типу Пейнтера, не були основним шляхом до зменшення селеніту. Таким чином, E. cloacae Z0206 ефективно відновлює селеніт до Se ° за допомогою фумарат-редуктази та утворює SeNPs; Цю здатність можна було б використати для розробки біореактора для обробки домішок Se та для біосинтезу SeNP у майбутньому.

вступ

Показано, що відновлення селеніту до Se ° опосередковується тіолами (мальовничими реакціями) в цитоплазмі як частина стратегії дезінтоксикації мікробів 29. Селеніт реагує з GSH і утворює селенодіглутатіон (GS-Se-SG), який додатково відновлюється до глутатіону селеноперсульфіду (GS-Se -) за допомогою НАДФН-глутатіонредуктази. GS-Se - є нестійким проміжним продуктом і проходить реакцію гідролізу з утворенням Se ° та відновленим GSH. На додаток до мальовничих реакцій повідомляється, що ряд кінцевих редуктаз для анаеробного дихання, дві нітрит-редуктази, індуцибельна сульфітредуктаза та фумарат-редуктаза здатні зменшувати селеніт у клітинах 30, 31, 32. 33 .

Показано, що Enterobacter cloacae SLD1a-1, селенат-дихаючий факультативний анаероб, каталізує відновлення селенату та селеніту до Se ° 12, 34, 35 1, 5 мМ). Показано, що зменшення селенату опосередковується мембранно-зв’язаним молібдоферментом 36, 37, але механізм відновлення селеніту в цьому штамі не з’ясований. Крім того, всі тести на зниження селеніту з участю E. cloacae проводили в анаеробному середовищі, а селеніт-здатність E. cloacae ще не перевірена в аеробних умовах. Було встановлено, що E. cloacae Z0206, штам, який ми виділили з гриба рейші (Ganoderma lucidum) "м'ясо" 38, має чудову стійкість до селеніту і переносить більше 100 мМ селеніту. У цьому дослідженні ми розглядали (i) здатність E. cloacae Z0206 зменшувати селеніт в аеробних умовах, (ii) властивості та розташування продукованих SeNP, та (iii) механізм відновлення селеніту у штамі Z0206.

Результати і обговорення

Профіль росту та селенітоздатна здатність E. cloacae Z0206 при різних концентраціях селеніту

біогенез

Зменшення росту та селеніту E. cloacae Z0206 за наявності різних концентрацій селеніту. ( А. Очевидні зміни в спожитому бульйоні. ( B. ) Профіль росту при різних концентраціях селеніту. Зразки 1 мл культури бактерій збирали через різні інтервали часу росту бактерій, а потім центрифугували протягом 10 хвилин при 4 ° C і 10000 x g. Білок екстрагували з гранул за допомогою набору для вилучення загальних бактеріальних білків. Ріст бактерій вимірювали кількісно визначаючи загальний клітинний білок. Визначали концентрацію білка в екстрактах клітин бактерій. ( C. ) Кількість бактерій в момент часу 96 год. ( Д. ) Динамічні зміни залишку селеніту у відварі. ( E. ) Кінетичне дослідження відновлення селеніту E. cloacae Z0206 при різних концентраціях селеніту. Лінійні діаграми та гістограми представлені як середнє значення ± SD, ** P

наночастинок

Характеристика та локалізація SeNP, синтезованих E. cloacae Z0206. ( А. ) SEM-зображення E. cloacae Z0206 та SeNP. ( B. ) EDX-аналіз вмісту вуглецю, азоту, кисню та селену в межах ( А. ). ( C. ) Елементарний картографічний аналіз розподілу селену, вуглецю, кисню та азоту в діапазоні ( А. ). ( Д. ) ТЕМ-зображення E. cloacae Z0206 та SeNP. ( E. ) EDX-аналіз частинок 1 і 2 в ( Д. ). ( Ф. ) Se 3D XPS з високою роздільною здатністю очищених SeNP, синтезованих з E. cloacae Z0206.

Знижуюча селеніт здатність різних фракцій клітин з клітин E. cloacae Z0206

аеробний

Знижуюча здатність селеніту до різних фракцій E. cloacae Z0206. Знижувальну здатність селеніту бактерії оцінювали за допомогою такої реакційної суміші: 100 мкг білка, 10 мМ селеніту та 10 мМ NADH у 200 мкл трис-HCl (рН 7,5). Реакційну суміш інкубували при 37 ° С протягом 8 годин. Реакційна суміш з усією фракцією клітин і без селеніту служила позитивним або негативним контролем.

iTRAQ-аналіз білків E. cloacae Z0206 у відповідь на селеніт

Серед ідентифікованих білків селеніт викликав 2,42-кратне збільшення частоти фумаратредуктази (табл. 1). Лі та ін. 33 показали, що відновлення селеніту в Shewanella oneidensis MR-1 опосередковується фумарат-редуктазою, що вказує на те, що фумарат-редуктаза може відігравати певну роль у процесі відновлення селеніту у E. cloacae Z0206. Однак найчастіше очікувані антиоксидантні білки, такі як глутатіонсинтетаза, глутатіонредуктаза, глутатіондисульфідредуктаза, тіоредоксин, тіоредоксинредуктаза та тіоредоксинзалежна тіолпероксидаза, не показали значних змін у відповідь на лікування селенітом (див.

Аналіз частоти мРНК виділених генів

Для перевірки результатів аналізу iTRAQ оцінювали частоту іРНК ферменту фумаратредуктази (frd) та антиоксидантних ферментів глутатіонсинтетази (gsh A), глутатіонредуктази (gor), тіоредоксину (trx A) та тіоредоксинредуктази (trx B). Як показано на фіг.4, експресія мРНК gsh A, gor, trx A і trx B в клітинах після стимуляції селенітом не відрізнялася від експресії до лікування селенітом. Однак лікування селенітом сприяло експресії мРНК frd залежно від часу. Ці дані підтвердили, що E. cloacae може відновлювати селеніт Z0206 до Se 0 за допомогою фумарат-редуктази замість реакції, опосередкованої GSH типу Пейнера.

біогенез

Вплив селеніту на транскрипцію фумаратредуктази та ферментів, що беруть участь у живописних реакціях. Культуру E. cloacae Z0206 протягом ночі доводили до OD 600 = 1 і розводили у свіжому бульйоні (1%). Коли культура досягла стаціонарної фази, відбирали 2 мл проби культури (як контроль без Se). Потім 500 мкм Додавали 1 аликвоту вихідного розчину селеніту натрію (1 М) і культуру інкубували ще 120 хвилин. Зразки збирали через 30 хвилин, 60 хвилин і 120 хвилин після додавання селеніту. * P

аеробний

Вплив BSO на ріст та зменшення селеніту у E. cloacae Z0206. ( А. ) Зростання E. cloacae Z0206 у присутності 1,5 мМ, 3,0 мМ та 5,0 мМ BSO. Потім клітини інкубували у присутності 5 мМ селеніту з додаванням 0 мМ, 1,5 мМ або 3,0 мМ BSO. Проби відбирали у різний час для визначення залишків селеніту, а клітинні проби відбирали через 24 години, 48 годин та 72 години для вимірювання внутрішньоклітинних концентрацій GSH. ( B. ) Відновлення селеніту в присутності BSO. Результат перетворювали у відсотках від початкової концентрації селеніту. ( C. ) Вплив BSO на внутрішньоклітинні концентрації GSH. * P 33 існував, і фумарат-редуктаза може бути основним шляхом відновлення селеніту у E. cloacae Z0206.

біогенез

Методи

Штам бактерій Z0206 та умови культивування

E. cloacae Z0206, штам, який ми раніше виділили 38, знаходився в оптимізованому бульйоні (сахароза 25, триптон 5, екстракт дріжджів 5, K 2 HPO 4 · 3H 2 O 2, 62, KH 2 PO 4 1, MgSO 4 0,5 дюйма) культивованого g L −1) при 32 ° C і 250 об/хв.

Ріст бактерій при стресі селеніту

Вплив селеніту на ріст E. cloacae Z0206 визначали у присутності 0 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ та 15 мМ селеніту натрію. Селеніт натрію готували у вигляді 1 М розчину і стерилізували фільтруванням. Потім 500 мл колби Ерленмейєра, що містять 100 мл відвару, доповнювали зростаючими концентраціями селеніту (0 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ і 15 мМ), і бактеріальну культуру протягом ночі знижували до OD 600 встановлений = 0,5 і інокулюється (1% розміру посівного матеріалу) до згаданого бульйону, що містить різні концентрації селеніту, з подальшою інкубацією при 32 ° C, 250 об/хв протягом 96 год.

Визначення концентрації селеніту

Культуру збирали і центрифугували при 10000 х г протягом 10 хвилин. Супернатант збирали для виявлення залишкового селеніту за допомогою флуорометричного методу 2,3-діамінонафталіну 41. Додаткову інформацію про виявлення селеніту можна знайти в розділі 1.2 під "Додатковою інформацією".

SEM та EDX аналіз

Збирали культури Z0206 у присутності різних концентрацій селеніту (0 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ і 15 мМ). Ці зразки центрифугували при 4 ° С і 12000 х г протягом 15 хвилин, а потім гранули промивали (0,1 М PBS), фіксували, висушували і наносили покриттям з розпиленням, з подальшим спостереженням під СЕМ. Карти складу елементів вибраних районів аналізували за допомогою системи EDX.

Аналіз TEM та EDX

Збирали культури Z0206, вирощені в присутності різних концентрацій селеніту (0 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ і 15 мМ). Ці зразки центрифугували протягом 15 хв при 4 ° C і 12000 × g, а потім гранули промивали (0,1 М PBS), фіксували, сушили і закладали. Ультратонкі зрізи 100 нм вирізали і фарбували з подальшим спостереженням під ТЕМ. Елементарний склад вибраних частинок аналізували за допомогою системи EDX.

Див. Аналіз валентності частинок

E. cloacae Z0206 культивували у присутності 5 мМ селеніту протягом 72 годин при 32 ° С та 250 об/хв. Частинки селену отримували з культури згідно з методом, описаним Dobias et al. Відокремлений розроблений протокол. 42. з невеликими змінами. Коротко кажучи, культуру декантирували з подальшим простим центрифугуванням при 4 ° С при 8000 х г протягом 10 хвилин для відділення суспендованої біомаси. Зібрані частинки Se, присутні в надосадовій рідині з попередньої стадії центрифугування, концентрували центрифугуванням при 4 ° C і 20000 x g протягом 15 хвилин. Потім гранулу ліофілізували та аналізували за допомогою XPS.

Поділ фракцій клітин та визначення селеніт-відновлювальної активності

Культуру E. cloacae Z0206, вирощену до експоненціальної фази без селеніту, збирали і центрифугували протягом 10 хвилин при 4 ° C та 10000 x g. Потім супернатант збирали і фільтрували за допомогою 0,2 мкм фільтра. Далі гранулу двічі промивали 10 мМ трис-HCl (рН 7,5) і ресуспендували в тому ж буфері для обробки ультразвуком з наступним центрифугуванням при 4 ° C при 6000 x g протягом 10 хвилин для відокремлення незламних клітин. Потім супернатант центрифугували при 4 ° C при 25000 × g протягом 40 хвилин для розділення фракцій цитоплазми (супернатант) та мембрани (гранул). Концентрацію білка вимірювали за допомогою набору для аналізу BCA.

RT-PCR аналіз

РНК екстрагували за допомогою міні-набору RNeasy Protect Bacteria. Загальну РНК піддавали реакції зворотної транскрипції за допомогою набору зворотної транскрипції Quanti Tect. Кількісну ПЛР проводили за допомогою системи ПЛР у режимі реального часу StepOne Plus ™, використовуючи FastStart Universal SYBR Green Master (ROX).

Визначення внутрішньоклітинних концентрацій GSH

Клітини, зібрані в результаті експерименту щодо "Впливу BSO на відновлення селеніту у E. cloacae Z0206" у часові моменти 24 год, 48 год і 72 год, концентрували центрифугуванням при 10000 × g, 4 ° С протягом 10 хв. і ресуспендували в 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), після чого клітини руйнувались за допомогою ультразвуку. Порушені клітини центрифугували при 20000 х g протягом 15 хвилин і супернатанти збирали для визначення концентрації GSH за допомогою набору для аналізу загального глутатіону.

Побудова f першого мутанта

& Dgr; перший мутант був побудований, як повідомлялося в іншому місці 43. Коротко, злитий фрагмент гена frd ампліфікували та лігували за допомогою ПЛР, потім лігували з pLP12 і згодом трансформували в Escherichia coli β2163. Отримані плазміди вводили в E. cloacae Z0206 кон'югацією з E. coli β2163. Після двох раундів відбору мутант, що несе видалений ген frd, був перевірений за допомогою ПЛР з використанням праймерів, які відповідали послідовностям до і після делеції (див. S4 у Додатковій інформації), а потім секвенували.

статистика

Односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA) з подальшим тестом багаторазового порівняння LSD використовували для визначення статистичної значущості для багаторазових порівнянь, а t-критерій Стьюдента - для парних порівнянь. P