Аналіз метаболічного профілю протоколу ембріонів даніо (переклад на французьку)

Резюме

Рибки даніо - це потужна модель хребетних, яка була недостатньо використана для метаболічних досліджень. Тут ми описуємо швидкий спосіб вимірювання in vivo метаболічного профілю розвитку даніо, який дозволяє порівняти різні параметри функції мітохондрій між генетично або фармакологічно маніпульованими ембріонами, тим самим збільшуючи придатність цього організму.

Анотація

Протокол

Частина 1: Хімічна обробка ембріонів даніо

Збирають ембріони даніо після запліднення. Інкубуйте при 28,5 ° C у середовищі E3 у чашках Петрі розміром 100 × 15 мм. Примітка: Для гібридизації in situ або фарбування червоним маслом-O додають 1-феніл-2-тіосечовину (ПТУ) у кінцевій концентрації 0,2 мМ, щоб інгібувати утворення пігменту, 1 але не потрібно для аналізу гіпокампа.
Для фармакологічних досліджень додайте необхідну хімічну речовину в кінцевій концентрації, яка відповідає розвитку ембріонів даніо, приблизно через 26 годин після запліднення (HPF) за допомогою відповідної команди, що виконується самостійно. Примітка: чутливі до світла, фармакологічні інгібітори можуть дозволити розвитку ембріонів у темному фронті під час аналізу.

Частина 2: Прямий метаболічний профіль за допомогою аналізатора Hippocampus XF 24

В кінці тестів розраховуються середні значення порядку 10 і 10 хімічно оброблених ембріонів.

Частина 3: Червоне масло O забарвлення

Ембріони з потужністю 50 к.с. видаляються з використанням тонких щипців і фіксуються в 4% PFA протягом ночі при 4 ° C.
Проводиться O-фарбування червоним маслом, як описано раніше 2 (див Малюнок 4).

Репрезентативні результати

Нас цікавить розуміння ролі конкретних генів у метаболізмі, зокрема частоти дихання та ліпідного обміну. Отже, ми лікували ембріони диких даніо з ВПЧ типу 26 місяця специфічним фармакологічним інгібітором ферменту, кодованого одним із цих генів. При 50 hpf половину ембріонів, оброблених носієм та інгібітором, аналізували, використовуючи морського коника на мітохондріальну функцію, тоді як для другої половини встановлювали 4% PFA протягом ночі при 4 ° C, а потім фарбували для осадження ліпідів олійно-червоним-O. Лікування специфічним інгібітором ферменту призвело до

В 2 рази більше базального дихання (малюнок 4А), що було пов’язано зі збільшенням відкладення ліпідів, особливо у відділах телецефалону та нижче пухирця на вуху (Малюнок 4B, C).

pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>Рисунок 1. Схематичне зображення хімічної обробки ембріонів даніо. Ембріони дикого типу, генно-інженерні або фармакологічно оброблені даніо данини є фоном.

Малюнок 2. Острівна плита XF24 на місці. (А) Чотири лунки містять ембріональне середовище лише як регулятор температури (позначено значком X), а інші містять один ембріон/лунку. (B) Закриття свердловини (C6), на якій зображено ембріон дикого типу потужністю 50 к.с., оброблений транспортним засобом (DMSO), покритий знімком екрану островка (стрілка).

Малюнок 3. ДихальнийПараметри іонів дикого типу для 50 ембріонів данило HPF. (А) Для кожного вимірювання представлено середнє значення 20 окремих ембріонів. Базальне дихання (середнє: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), максимальне дихання (середнє: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), дихальна здатність для порятунку (середнє: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) Для кожного вимірювання показано середнє з 20 окремих результатів. Базальне мітохондріальне дихання; дихання мітохондрій внаслідок обміну АТФ; нерозв’язане дихання мітохондрій та немітохондріальне дихання. Mt: мітохондріальна; SRC: Запасна частина Дихальна здатність; SD: стандартне відхилення, SEM: стандартна помилка середнього значення. Результати представлені в пмолях споживаного O 2/хв/ембріон. Натисніть тут, щоб збільшити малюнок .

Рисунок 4. Представникрепрезентативні результати хімічного впливу на базальне дихання та відкладення ліпідів. (A, B) Ембріони 50 к. С., Забарвлені червоним маслом O в поперечному вигляді. Ембріон, інкубований із селективним інгібітором (B), виявляє більше масляного червоного O-фарбування в теленцефалоні (голівка стрілки) та нижче пухирця вуха (стрілка) порівняно з контрольним ембріоном, обробленим носієм. (C) Базальне дихання показує a

У 2 рази більше у хімічно оброблених ембріонів (n = 10 ембріонів на групу). Результати представлені в пмолях O 2/хв/ембріон.

Обговорення

Данио є добре усталеною генетичною моделлю як прямого (мутагенез ЕНУ), так і зворотного (Тіллінг, цілеподібний ноказ цинкової пальці, збитий морфоліно) 3,4 генетичного підходу, тоді як функція генів в зародках даніо також може бути легко блокується або активується за допомогою селективних фармакологічних сполук, специфічних для кодованих продуктів. Завдяки своєму зовнішньому розвитку та невеликим розмірам, ембріони даніо особливо придатні для метаболічного аналізу. Однак надійного вимірювання метаболічного профілю та функції мітохондрій in vivo в ембріонах даніо не було досягнуто, повідомляється лише одне попереднє опис 5. Аналіз морського коника спочатку був розроблений для клітинних та метаболічних досліджень. Було показано, що він дає точні та надійні результати 6. Застосування цього нового методу зародків даніо є важливим і, ймовірно, збільшить ширше використання цієї моделі для метаболічних досліджень.

У цьому дослідженні ми демонструємо вимірювання ряду параметрів дихання в ембріонах даніо за допомогою аналізатора морського коника, включаючи базальне дихання, максимальне дихання, дихальну здатність в режимі очікування, відновлення АТФ та витік протону. Ми також наводимо приклад того, як ці вимірювання можна співвіднести з іншими фізіологічними параметрами, в даному випадку накопиченням ліпідів та використанням фармакологічних інгібіторів цієї дозуючої системи. У поєднанні з використанням організмів, генетично модифікованих ембріонами, це забезпечує потужну експериментальну платформу для розуміння факторів, що впливають на обмін речовин.

Цей метод все ще має певні обмеження. Хоча ми та інші змогли використовувати олігоміцин для вимірювання продукції АТФ та витоку протонів на молодих ембріонах 5 (див. малюнок 3), у ембріонів, що перевищують 60 к.с., лікування олігоміцином неефективне. Ми вважаємо, що у старих ембріонів олігоміцин може дифундувати не так легко, як у молодих ембріонах, що робить результати неможливими для інтерпретації. Оскільки результати визначення олігоміцину є обов’язковими для визначення дихання через обмін АТФ та роз’єднане дихання, ми в даний час досліджуємо більш високі концентрації олігоміцину для старих ембріонів. Однак лікування антиміцином А залишається ефективним і довше, при цьому інші заходи, такі як базальне дихання, максимальне дихання та рятувальна дихальна здатність, можна проводити у вікових ембріонах даніо до 68 к.с. (не показано).

Іншим обмеженням у використанні поточної установки Аналізатора морського коника є фізичний простір у кожній захоплюючій пластині та острівці, тому вони підходять лише для ембріонів даніо та молодих личинок. Тому проведення метаболічних досліджень дієти, спричинених ожирінням у дорослих риб, наприклад, поки що технічно неможливо. Однак це дослідження може підштовхнути до розробки спеціально розроблених тарілок для неповнолітніх та дорослих риб, таким чином розширивши сферу можливих аналізів.

Розкриття інформації

Відсутність заявленого конфлікту інтересів.

Подяка

Автори хотіли б подякувати співробітникам Фонду університету Zebrafish Deakin за надання чудового постійного племінного догляду. YG підтримується стипендією Альфреда Дікіна та докторською стипендією університету Дікіна. SLM підтримується стипендією NHMRC з розвитку кар'єри. ACW підтримується грантом NHMRC. Усі автори підтримуються Центром молекулярних та медичних досліджень при Університеті Стратегічного Дікіна.