ДИСЕРТАЦІЯ для здобуття ступеня доктора хімічного факультету

1 Визначення продуктів амінокислотного радіолізу орто-тирозину та 3- (4-гідроксифеніл) пропіонової кислоти як доказ γ-опромінення продуктів, багатих білками ДИСЕРТАЦІЯ для здобуття докторської ступеня на кафедрі хімії Університету Гамбурга в Інституті біохімії та хімії харчових продуктів - Університеті Гамбурга презентувала Яна Хунькова з Кладно Гамбург 23

факультету

2 Ця робота була проведена в період з жовтня 1998 року по 22 вересня під керівництвом професора д-ра. Лікар. Ганс Штейнхарт з Інституту біохімії та хімії харчових продуктів - кафедра хімії харчових продуктів. 1-й рецензент: проф. Д-р Лікар. Ганс Штайнхарт 2-й рецензент: проф. Біспінг

3 Подяка На цьому місці я хотів би подякувати усім, хто підтримав мене у підготовці цієї тези: проф. Лікар. Я хотів би подякувати Гансу Штайнхарту за тему та велику підтримку. Професор доктор Я дякую Біспінгу за те, що він взяв на себе презентацію. Лікар. Я хотів би подякувати Томасу Сімату за його постійну готовність до обговорення та співпрацю, що сприяло успіху цієї роботи. Я хотів би подякувати усім колегам з кафедри харчової хімії в Гамбургському університеті за їх добру співпрацю. Я хотів би подякувати компаніям Beiersdorf AG та GAMMASTER GmbH за опромінення зразків. Я вдячний Daimler-Benz та Фонду Х. Вільгельма Шаумана за фінансову підтримку цієї роботи. Дякую своїм батькам за невичерпне терпіння. Я хотів би подякувати своїм друзям Рут, Іржі, Роберту, Брітті, Астрід, Керстін, Луї та Маріані за виправлення роботи та іншу різноманітну підтримку.

4 Список скорочень 4 Список скорочень 3,2-HPPA 3,3-HPPA 3,4-HPPA λ Ex λ Em AP-ESI BgVV CV Em ESR EU Ex FAO FIA FL FLD GC HCl HPLC IAEA IS kgy LMBG M m/z MeCN MeOH min MS MSD MW n 3- (2-гідроксифеніл) -пропіонова кислота 3- (3-гідроксифеніл) -пропіонова кислота 3- (4-гідроксифеніл) -пропіонова кислота Довжина хвилі збудження Атмосферний тиск Електроспрей Іонізація Федеральний інститут охорони здоров'я споживачів та ветеринарна медицина Ефективність спектроскопії Енергія Енергія Ексцентрація Ехоцентрація Енергія Енергія Енергія Енергія Ексцентрація Енергія Енергія Ексцентрація Енергія Енергія Енергія Енергія Енергія Енергія Ексцентрація Емоція Енергія Енергія Енергія Енергія Енергія та сільськогосподарська організація Інжекційний аналіз Флуоресценція Флуоресценція Виявлення Газова хроматографія Соляна кислота Високопродуктивна рідинна хроматографія Міжнародне агентство з атомної енергії Внутрішній стандарт Кіло сірий Продукти харчування та товари Молекулярна маса Співвідношення Маса до заряду Ацетонітрил Метанол Хвилини Масова спектрометрія Маса Селективна кількість вибірки

5 Список скорочень 5 пп. n.b. NH 4 ацетат NH 4 формат NWG PE Phe RP RT SIM SPE TFA TL Tyr UV v/v WHO WFR не виявляється не визначено амоній ацетат амоній формат аміаку межа виявлення поліетилен фенілаланін зворотна фаза кімнатна температура одномоментний моніторинг тверда фаза екстракція трифтороцтова кислота термолюмінесценція тирозин ультрафіолетовий коефіцієнт відновлення об'єм ультрафіолету

6 Зміст 6 Зміст 1 ВСТУП ЦІЛЬ ТЕОРЕТИЧНІ ПРИНЦИПИ Опромінення їжі Хімічні ефекти іонізуючого випромінювання Первинний ефект опромінення Вторинний ефект опромінення Вплив дози опромінення Вплив дози опромінення Вплив температури під час опромінення Зміна їжі під час заморожування МІСЦЕВОГО ШРИЛКА РОЗРОБКА МЕТОДІВ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ О-ТИРОЗИНУ Оптимізація хроматографічних умов Оптимізація виявлення Флуоресцентне виявлення (FLD) Масово-селективне виявлення (MSD) Розробка очищення Депротеїнізація Гомогенізація Ізоляція о-тиру за допомогою твердофазної екстракції Обговорення МЕТОДИКА -ГІДРОКСИФЕНІЛ) -ПРОПІОНОВА КИСЛОТА Оптимізація хроматографічних умов. 43

7 Зміст Оптимізація виявлення Розробка очищення Депротеїнізація Виділення та збагачення 3- (4-гідроксифеніл) пропіонової кислоти за допомогою рідко-рідинної екстракції Виділення та збагачення 3- (4-гідроксифеніл) пропіонової кислоти за допомогою твердофазної екстракції Валідація Обговорення ДЕТЕРМІНАЦІЯ ФЕНІЛА І Р-ТІРОЗИН В БАГАТИЙ НА ПРОТЕІНИ ХАРЧУВАННІ ВИЗНАЧЕННЯ О-ТІРОЗИНУ У γ-опроміненій БАГАТОЇ НА ПРОТЕІНИ ХАРЧУ Вплив температури Визначення о-тирозину при багатих білками харчових продуктах Визначення о-тирозину в заморожених, опромінених продуктах, багатих білками опромінення - глазурування вмісту о-тирозинового фону в неопромінених зразках Взаємозв'язок між вмістом фенілаланіну та індукованим радіацією утворенням о-тирозину ВИЗНАЧЕННЯ 3- (4-ГІДРОКСИФЕНІЛ) -ПРОПІОНОВОЇ КИСЛОТИ В γ-опромінених БІЗАТИННИМ БІЛКОМ ПРОДУКТІВ вміст р-тирозину та радіаційне утворення 3- (4-гідроксифеніл) пропіонової кислоти РЕЗЮМЕ ОБГОВОРЕННЯ - РЕЗЮМЕ Резюме Резюме ЛІТЕРАТУРА. 82

9 Зміст Аніоніти Валідація процесу для визначення 3- (4-гідроксифеніл) пропіонової кислоти Визначення 3- (4-гідроксифеніл) пропіонової кислоти в γ-опромінених продуктах, багатих білком Результати γ-опромінення харчових продуктів Визначення 3- (4-гідроксифенілу) - хроматограми пропіонової кислоти. 125

14 1 Вступ 14 реагують ті самі продукти окислення. Новий підхід до ідентифікації γ-опромінених продуктів, багатих білком, і в той же час нежирних продуктів пропонує визначення нового потенційного маркера випромінювання 3,4-HPPA. На основі скринінгу КЛІБЕРГ (22) виявив цей продукт амінокислотного радіолізу в різних продуктах, багатих білком, опромінених γ, таких як креветки Північного моря, куряча грудка та інші види креветок. Цей маркер випромінювання був виявлений як при кімнатній температурі, так і в заморожених опромінених продуктах. Були виявлені суттєві відмінності між рівнями 3,4-HPPA в неопромінених та опромінених зразках. 3,4-HPPA визначали за допомогою ВЕРХ/FLD. Цю процедуру ще не можна використовувати як звичайну процедуру.

16 3 Теоретичні основи 16 3 Теоретичні основи 3.1 Опромінення харчових продуктів Для опромінення харчових продуктів дозволено три різні види випромінювання (CODEX ALIMENTARIUS, 1984): γ-промені радіонуклідів 6 Co (штучно виробляються з 59 Co, два γ-кванти з випромінюються з енергією 1,17 МеВ та 1,33 МеВ) γ-промені радіонуклідів 137 Cs (від ділення ядра виділяється γ-квант із відносно низькою енергією, 66 МеВ) β-промені до енергії Рентгенівське випромінювання 1 МеВ (вторинне випромінювання від прискорювача електронів) до енергії 5 МеВ. Для опромінення їжі найчастіше використовують γ-промені, оскільки вони мають високу проникаючу здатність речовини порівняно з β-променями і тому добре підходять для опромінення продуктів на піддонах (DIEHL, 1995). Залежно від області застосування випромінювання використовуються різні дози випромінювання від .5 до 1 кг. Діапазон високих доз більше 1 кг не призначений для комерційних продуктів харчування, але використовується для спеціальних цілей для стерилізації. Деякі сфери застосування з максимально дозволеними дозами опромінення наведені в таблиці 2 (МАГАТЕ, 2).

18 3 Теоретичні принципи 18 радіолітично розщеплені, з наступними продуктами радіолізу, які по суті мають місце (рівняння 4) (DRAGNIC and DRAGNIC, 1963, VON SONNTAG, 1987, DODD, 1995): H 2 O OH + e - aq + H + H 3 O + (рівняння 4) Вторинний ефект випромінювання Вільні радикали, що утворюються внаслідок первинного ефекту іонізуючого випромінювання, дуже реактивні і можуть реагувати між собою або з харчовими інгредієнтами, що призводить до вторинних продуктів випромінювання. Отримані види можуть продовжувати реагувати наступним чином (рівняння 5, 6, 7): R + H RH комбінація (рівняння 5) R + R RR димеризація (рівняння 6) RH + + e - aq RH захоплення електронів (рівняння 7 ) Гідроксильні радикали як первинні продукти радіолізу води мають сильну окислювальну дію. Вони особливо реакційноздатні щодо ненасичених сполук та сполук з ароматичними кільцями (KARAM та SIMIC, 1989, WANG та ін., 1993). Коли OH-радикал атакує Phe, відбувається додавання до ароматичного кільця з утворенням чотирьох можливих проміжних продуктів (рис. 1). Три з них (1, 2, 3) призводять до утворення гідрокси-Phe, тоді як форма Ipso (4) призводить до невідомих продуктів (WANG et al., 1993). Рисунок 1: Утворення радикалів гідрокси-Phe через первинний та вторинний ефекти

23 3 Теоретичні основи 23 Нормалізація функцій травлення в (GUTSCHMIDT, 1964). З ліпідів виділяються ферментативно вільні жирні кислоти. Їх утворення залежить від температури і повільніше при нижчих температурах, ніж при більш високих. Ферменти зазвичай не руйнуються в процесі заморожування. Вони можуть знову бути повністю активними при підвищенні температури. Ферменти псування жиру, напр. Ліпази та ліпоксидази все ще активні навіть при низьких температурах і призводять до утворення продуктів розпаду жиру (альдегіди, кетони, кислоти, пероксиди) та до розщеплення фосфатидів (HERRMANN, 197).

31 5 Розробка методів визначення о-тирозину 31 3 Довжина хвилі (нм) максимальне значення випромінювання максимуму викиду ph Рисунок 5: Вплив значення ph на максимум збудження та випромінювання Оптимізація інтенсивності флуоресценції Флуоресцентні властивості ізомерів Tyr залежать від значення ph . З цієї причини досліджували вплив значення рН буфера на інтенсивність флуоресценції о-тиру і, отже, також на чутливість детектування. З цією метою флуориметрично вимірювали розчини о-тиру у фосфатному буфері зі значеннями рН від 1,5 до 9,3 (λex = 275 нм, λem = 35 нм). Було встановлено, що інтенсивність флуоресценції досягає максимуму в діапазоні рН 4-5 (рисунок 6). Значення інтенсивності флуоресценції (%) ph Рисунок 6: Залежність інтенсивності флуоресценції o-tyr від значення ph Наступну процедуру застосовували для перенесення результатів, отриманих з фосфатним буфером, у випробувані рухомі фази. Розчин о-тиру в тому, що розроблений HEIN та співавт. (2) використовуваного елюенту, 1% TFA (рН 1,8) також вимірювали флуориметрично (λex = 275 нм, λem = 35 нм). O-тир також досліджували у розчині 0,5 моль/л NH4формату при рН 3, 4 та 4,5. Максимальна інтенсивність флуоресценції була отримана за допомогою розчину о-тиру в буфері NH4формату при рН 4