Експресія клітинного інгібітора апоптозу білка-2 в підшкірних та

  • реферат
  • вступ
  • Методи
  • Суб'єкти та вибірки
  • Препарат РНК та RT-PCR
  • Виділення білка та аналіз вестерн-блот
  • Виявлення апоптозу
  • Статистичний аналіз
  • Результати
  • обговорення
  • день подяки

реферат

ЦІЛЬ: В сьогодення У цьому дослідженні ми розглядали питання про те, чи існує депо-специфічна експресія клітинного інгібітора апоптозу білка-2 (cIAP2) ще в дитинстві і чи змінюється відносна експресія із збільшенням віку із збільшенням ризику вісцерального ожиріння.

Предмети: 23 пацієнти (12 дітей та 11 дорослих) отримано парні зразки жирової тканини людини (ОМ) та підшкірної жирової тканини (СК).

МЕТОД: Рівні мРНК cIAP2 визначали, використовуючи ланцюгову реакцію полімерази зворотної транскрипції (RT-PCR) та експресію білка, підтверджену Вестерн-блот. Індекси апоптозу визначали за допомогою термінального дезоксинуклеотидилтрансферази, опосередкованого dUTP-флуоресцеїновим маркуванням (TUNEL).

РЕЗУЛЬТАТИ : мРНК cIAP2 була в 1,51 рази вищою в ОМ, ніж у жировій тканині СК (ОМ> СК у 20 з 23 суб'єктів; P СК у дев'яти з 10 суб'єктів, P 1

Ожиріння характеризується збільшенням маси жирової тканини. Маса жиру в організмі, особливо накопичення вісцерального жиру, тісно пов’язана з резистентністю до інсуліну, серцево-судинними захворюваннями, високим кров’яним тиском та іншими серйозними порушеннями обміну речовин. 2 Це показало важливість виявлення генетичних факторів, які регулюють не тільки масу жиру, але й розподіл жиру.

Відомо, що сальникові (ОМ) і підшкірні адипоцити (СК) відрізняються різними метаболічними властивостями, які регулюють обсяг жирових клітин. 3, 4 На реплікацію, диференціацію та апоптотичну реакцію жирових клітин людини впливає анатомічна область. 5, 6. Таким чином, розподіл жирової тканини можна пояснити різницею в регуляції цих процесів, характерною для певної ділянки. Нещодавно було показано, що регіональні особливості можуть бути пов’язані зі специфічними для місцевості відмінностями в експресії генів, що кодують важливі функціональні білки. 7 Наприклад, експресія γ лептину та PPAR є вищою у СК, ніж у жировій тканині ОМ. 8, 9 На відміну від цього, експресія рецептора інсуліну (Приклад 11-) вища в ОМ, ніж у жировій тканині СК. 9

Інгібітор клітинного апоптозу білка-2 (cIAP2) належить до сімейства білків апоптозу (IAP), який бере участь у регуляції апоптозу під час проліферації та диференціації клітин. 10, 11, 12 Роль ІАП у жировій тканині людини незрозуміла, але все більша кількість доказів свідчить про те, що вони можуть відігравати роль у регулюванні розподілу жиру в організмі за допомогою модуляції апоптозу жирових клітин. Один з довідок показав, що диференційована залежність експресії білка, що гальмує нейрональний апоптоз (NAIP) в адипоцитах 3T3-L1, може корелювати з розвитком стійкості адипоцитів до апоптозу. Два подальших дослідження повідомили, що мРНК cIAP2 специфічно депо експресується у жирових клітинах дорослої людини. 14, 15

До цього часу дослідження щодо відмінностей у експресії генів зосереджувались на дорослих. Дуже мало відомо про сайт-специфічну експресію гена в жировій тканині у дітей. Оскільки існують залежності від віку щодо маси та розподілу в жировій тканині людини, ми вирішили питання, чи існує депо-специфічна експресія cIAP2 ще в дитинстві, і якщо так, чи змінюється відносна експресія із збільшенням віку, і чи існує ризик вісцерального ризику Ожиріння. Тому в поточному дослідженні ми порівняли рівні експресії cIAP2 як на іРНК, так і на рівні білка в жировій тканині ОМ та СК дітей та дорослих. Крім того, ми вивчили взаємозв'язок між рівнем експресії cIAP2 та швидкістю апоптозу адипоцитів, індексом маси тіла (ІМТ) та статтю.

Методи

Суб'єкти та вибірки

Препарат РНК та RT-PCR

Рівні мРНК cIAP2 визначали у всіх суб'єктів, у яких загальна РНК була доступна як із жирової тканини SC, так і з ОМ. Загальну РНК готували з використанням реагенту TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Каліфорнія, США) згідно з протоколом виробника. РНК визначали кількісно спектрофотометрично. Цілісність РНК перевіряли фарбуванням етидієм бромідом смуг рибосомних РНК з використанням 1% агарозного гелю. Отриману РНК зберігали при -70 ° С до використання.

RT-PCR проводили для аналізу мРНК cIAP2. Загальну РНК (0,5 × 1 мкг) екстрагували протягом 1 години при 42 ° С у 20 мкл буфера, що містить 200 U MMLV зворотної транскриптази, 0,5 мкг оліго d (Т) 16, 0,5 ммоль/л dNTP, 20 U інгібітор РНК-ази, зворотна транскрипція. Додаткові зразки ДНК (кДНК) денатурували протягом 5 хв при 95 ° С, а 5 мкл кДНК від кожного зразка використовували для подальшої ампліфікації ПЛР в кінцевому обсязі 50 мкл буфера, що містить 2,5 U Taq ДНК-полімерази, 0, 2 ммоль/л, містив dNTP, 2,5 ммоль/л MgCl 2 і 0,4 мкмоль/л кожного праймера. Умови ПЛР становили 95 ° C протягом 5 хвилин, а потім 30 циклів по 94 ° C протягом 30 секунд, 60 ° C протягом 45 секунд і 72 ° C протягом 1 хвилини і, нарешті, розширення 72 ° C протягом додаткових 10 хвилин. Реагенти для RT постачала компанія Promega Corp. (Медісон, США). Реагенти для ПЛР були від компанії Roche (Мангейм, Німеччина). У цій напівкількісній RT-PCR одночасно використовували два набори праймерів (табл. 1). Було використано різну кількість циклів ПЛР, щоб переконатися, що ампліфікація як cIAP2, так і кДНК β-актину знаходилася в межах експоненціального діапазону. Праймери для β-актину додавали в шостому циклі кожної ампліфікації ПЛР.

Після ампліфікації 10 мкм. л суміші відокремлюють на 1,5% агарозному гелі, забарвленому бромідом етидію. Гелі візуалізували під ультрафіолетовим світлом, вимірювали та аналізували щільність та співвідношення cIAP2 до β-актину за допомогою програм для кількісного визначення версії 4 Windows та Macintosh (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія, США).

Виділення білка та аналіз вестерн-блот

Виявлення апоптозу

Апоптотичні адипоцити в 15 парних зразках були виявлені за допомогою термінального дезоксинуклеотидилтрансферази, опосередкованого dUTP-флуоресцеїновим маркуванням (TUNEL) відповідно до протоколу виробника. Апоптотичні індекси були отримані підрахунком 200 адипоцитів принаймні в чотирьох полях зору під світловим мікроскопом.

Статистичний аналіз

Дані аналізували за допомогою Статистичного пакету соціальних наук (SPSS), і значення Р менше 0,05 надало значення. Оскільки експресія cIAP2 зазвичай не розподілялася в жировій тканині, вона відображається в тексті та таблиці як медіана (міжквартильний діапазон). Тест підписаного рангу Вілкоксона був використаний для порівняння різниці експресії між SC та OM; Тест Манна-Уітні був використаний для порівняння специфічних для депо відмінностей між дітьми та дорослими. Кореляції розраховували за допомогою тесту коефіцієнта кореляції Спірмена.

Результати

Паралельні порівняння експресії мРНК cIAP2 з жирової тканини SC та OM були кількісно визначені за допомогою RT-PCR, як показано на малюнку 1а. Були помітні відмінності в рівні експресії між особами, особливо в ОМ (1b). Тим не менше, існувала значна депо-специфічна різниця у рівні експресії мРНК cIAP2 (табл. 2). мРНК cIAP2 була в 1,51 рази вищою в ОМ, ніж у жировій тканині СК (ОМ> СК у 20 з 23 суб'єктів; П.

експресія

Депо-специфічні відмінності у експресії мРНК cIAP2. (а) Приклад аналізу на агарозний гель після RT-PCR парних зразків жирової тканини SC та OM від п'яти осіб. (b) Точкові діаграми показують, що експресія мРНК cIAP2 присутня в жирах SC та OM від усіх особин. Горизонтальні смуги позначають медіану.

Вестерн-ляпці показані на фіг. За погодженням з експресією мРНК вміст білка cIAP2 був вищим у ОМ, ніж у СК (ОМ> СК у дев'яти з 10 досліджуваних, P.

інгібітора

Депо-специфічні відмінності у експресії білка cIAP2. (а) Приклад імуноблотів білків cIAP2 із жирової тканини SC та OM чотирьох осіб. (b) Точкові діаграми демонструють експресію білка cIAP2 у жирі SC та OM у 10 осіб. Горизонтальні смуги позначають медіану.

Імуногістохімічний аналіз не показав різниці між SC та OM в апоптотичних індексах адипоцитів (апоптотичні індекси 14, які показали вищу експресію мРНК cIAP2 в ОМ, ніж адипоцити SC дорослих. Ті ж автори також показали, що експресія мРНК cIAP2 в людських преадипоцитах ОМ вище, ніж у жирі СК15. Однак їх дослідження було зосереджене лише на рівні мРНК.Оскільки експресія мРНК не завжди відображає експресію білка або концентрацію повністю обробленого білка, ми розширили спостереження, додавши ми підтвердили, що основна різниця між жировою тканиною ОМ та СК також відбувається на рівні білка.

Спочатку cIAP2 був ідентифікований як білок, асоційований із сигнальним комплексом рецептора TNF-α, припускаючи, що він може брати участь у регуляції передачі сигналів TNF-α. 16 Надмірна експресія білка cIAP2 людини може придушити загибель клітин, спричинену різними подразниками. Порівняно з ізольованими людськими адипоцитами, преадипоцити, культивовані у сироватковому середовищі, мають більш високий рівень мРНК cIAP2, а також меншу чутливість до індукованого TNF-α апоптозу. 14, 15, 17 Отже, експресія cIAP2 в жировій тканині SC та OM може відображати специфічну для депо сприйнятливість до апоптозу і тим самим спричиняти втрату або відкладення жирової тканини.

У цьому дослідженні ми не змогли виявити різниці в рівні базального апоптозу між адипоцитами з двох депо. Ймовірне пояснення полягає в тому, що базальні апоптотичні індекси були занадто низькими, щоб їх можна було точно визначити та порівняти. Ця думка підтверджується тим фактом, що Prins et al. 17 показали, що базальний апоптотичний індекс жирових клітин, культивованих у сироватковому середовищі, був дуже низьким незалежно від використовуваного методу. 6 Однак ми не можемо виключити, що використаний метод є надто нечутливим, щоб виявити різницю в індексах апоптозу між двома ділянками жирової тканини, що може корелювати з різницею в експресії cIAP2. Крім того, фізіологічну роль різниці експресії, характерної для сайту, в cIAP2 в жировій тканині ще не досліджено.

Підсумовуючи, ми порівняли експресію мРНК cIAP2 у жировій тканині SC та OM у 12 дітей та 11 дорослих. Вища відносна експресія ОМ порівняно з жировою тканиною СК була виявлена ​​у дітей та дорослих. Це свідчить про те, що різне вираження cIAP2 між депо може бути зумовлене властивостями клітин двох депо. Більш виражена різниця, характерна для депо, у дітей може відображати чистий приріст вісцеральної жирової тканини під час росту.

день подяки

Цю роботу підтримали Фонд наукових досліджень Комітету з освіти Цзянсу (99KJD 320012) та Шведська рада з медичних досліджень (19X-05708). Ми вдячні пану Сю Сяокуну, пану Лу Яо, пану Чен Іцзяну та професору Пітеру Нареді за надання зразків жирової тканини для цих досліджень, а професору Томмі Олссону за плідні обговорення.