Харчові компоненти та їх вплив на патогенез аутоімунного діабету у людей та

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Кафедра харчової фізіології Харчові компоненти та їх вплив на патогенез аутоімунного діабету у людей та мишей Даніела Беттіна Мюллер Повна копія докторської дисертації, затвердженої Науковим центром харчування, землекористування та навколишнього середовища Мюнхенського технічного університету в Вейхенштефані. Доктор побутових та харчових наук Голова: Експерт дисертації: ун-т проф. Лікар. Дж. Дж. Хаунер 1. Університет-проф. Лікар. Х. Даніель 2-й апл. A-G. Циглер Дисертація була подана до Мюнхенського технічного університету 5 січня 2010 р. І прийнята Науковим центром харчування, землекористування та навколишнього середовища Вайхенштефана 25 лютого 2010 р.

патогенез

Для моїх двох дідусів

Зміст Зміст 1 Завдання. 1-3 2 Вступ та огляд літератури. 4-23 2.1 Основи діабету 1 типу. 2.1.1 Важливість генетики. 5-6 2.1.2 Патогенез та імунологічний фон діабету 1 типу. 6-8 2.2 Пшениця та її білкові фракції. 8-9 2.2.1 Целіакія та зв'язок між діабетом 1 типу та целіакією. 10-14 2.2.2 Вплив білків пшениці на розвиток аутоімунного діабету на тваринних моделях. 14 2.2.3 Тваринні моделі діабету 1 типу. 14-15 2.2.4 Вплив дієтичних факторів на розвиток аутоімунного діабету на моделях тварин. 16 2.3 Коров’яче молоко та його білкові фракції. 17-18 2.3.1 Вплив білків коров’ячого молока на розвиток аутоімунного діабету на моделях тварин. 18-19 2.4 Вплив пшениці та коров’ячого молока на діабет 1 типу людини. 19-21 2.5 Асоціація між пов’язаною з кишечником імунною системою та аутоімунним діабетом. 21-22 2.6 Інші харчові компоненти та їх можливий зв’язок із діабетом 1 типу. 22-23 3 Матеріал і методи. 24-41 3.1 Дослідження на моделі миші NOD. 24 3.1.1 Колектив мишей. 24 3.1.2 Дієти. 24-27 3.1.3 Протокол часткового експерименту 1 і 1а. 27-29 3.1.4 Протокол часткового експерименту 2. 29-30 3.1.5 Протокол часткового експерименту 3. 31 I.

Зміст Зміст. Список малюнків. Список таблиць. Список скорочень. I-V VI-VIII IX-X XI Попередні публікації. XII автобіографія. XIII-XIV подяки. XV V

Перелік рисунків Рис. 26 Зв'язування ІАА з молоком, молочними білками, сумішами та пшеницею порівняно з людським інсуліном. 74 Рис. 27 Криві зв'язування ІАА з харчовими компонентами. 75 Рис. 28 Криві зв'язування ІАА з білками молока. 76 Рис. 29 Зв'язування IAA з різними білками молока порівняно з інсуліном (частина 1). 77 Рис. 30 Зв’язування IAA з різними білками молока порівняно з інсуліном (частина 2). 78 Рис. 31 Зв'язування IAA з різними білками молока порівняно з інсуліном (частина 3). 79 VIII

Перелік таблиць Таблиця 20 Аналіз концентрації білка в екстрагованих харчових розчинах у різних розведеннях та отримані середні значення. 66-67 Таблиця 21 Характеристика досліджуваних, чиї ІАА зв'язуються з екстрактом сухого молока. 73 X

Список абревіатур Список абревіатур Рисунок Рисунок AK Антитіла Asp аспарагін cpm радіоактивні розпади в хвилину (відліки в хвилину) GAD (A) (антитіла проти) глутаматдекарбоксилази HLA комплекс гістосумісності (людський лейкоцитарний антиген) I (A) A Інсулін (ауто) антитіло IA-2 (A ) (Антитіла проти) білка тирозинфосфатази IA-2 ICA острівцевих клітин антитіла Ig імуноглобулін MHC основний комплекс гістосумісності хв. Хвилин nb невідомий NOD аналіз зв’язку без діабетів RBA з радіолігандами обертів об/хв об/хв. Таблиця діабету T1D типу 1. Таблиця TBST Буферований сольовий розчин Tris та Tween TBT Буферований Tris tween t-tg-транглутаміназа проти Транспортера цинку ZnT8 ВООЗ 8 XI

Вміти ставити завдання, які можна розглядати як потенційні вихідні цільові антигени IAA. Загалом, ця робота повинна розробити можливий вплив окремих компонентів їжі на імунний процес аутоімунного діабету. Використовуючи дані, отримані in vivo на моделі NOD, потенційно діабетогенні харчові компоненти тестують на сироватках людини. За допомогою цих моделей in vitro буде досліджено, наскільки імунні події діабету 1 типу спочатку можуть бути спричинені перехресними реакціями з харчовими компонентами. Результати цих експериментів могли б описати подальші, раніше невідомі механізми патогенезу діабету, і, отже, використовуватись для розробки первинних методів лікування для запобігання розвитку діабету 1 типу в ранньому дитинстві. 3

Матеріал і методи (дієта D), друга група залишалася на пшеничносодержащей дієті A, а третя група залишалася на безжитній дієті B. самки тварин, які залишились на дієті С (див. рис. 4). Розмноження пар Безглютенова дієта, що містить казеїн B Дієта без глютену та казеїну C Тестові групи Дієта B n = 12 Дієта A n = 12 Дієта D n = 12 Дієта C n = 9 Рис. 1. Самці молодих тварин племінної групи безглютенової дієти В були відокремлені від дамб після лактації у віці трьох тижнів, як описано для жіночих тварин, і розділені на три тестові групи. Аналогічно групуванню самок мишей, одна з груп отримувала еталонну дієту (дієта D), друга - пшеничну дієту А, а третя група залишалася на безжитній дієті В (див. Рис. 4а). Розмноження пар безглютенової, що містить казеїн дієти B Тестові групи Дієта B n = 11 Дієта A n = 10 Дієта D n = 12 Рис. 4a Розподіл самців мишей NOD до племінних та дослідних груп у суб-експерименті 1a. 28

Матеріал та методи Для того, щоб відокремити білкові фракції, що містяться в пшениці, одна від одної проводили модифіковану триступеневу екстракцію На останньому етапі глютеніни були розділені (Wilson and Goulding 1991, Mimouni et al. 1998, Nicolas et al. 1998 Idris et al. 2003). Екстракція борошняних альбумінів та глобулінів Центрифугування> 2x осаду Екстракція гліадину Центрифугування> 3x Екстракція глютелінового осаду (атмосфера N 2) Центрифугування> 2x центрифугування всіх супернатантів Зберігання опадів при 18 C Рис. 7 Схема вилучення білка та виділення фракцій із пшеничного борошна. 0,1 г комерційно доступного пшеничного борошна типу 550 зважували, додавали 1 мл буфера Серенсена (рН 7,35) і суміш струшували при 4 ° С протягом 20 хвилин. Після центрифугування (20 хв, 1000 об/хв, суперскоростна центрифуга Sorvall RC 5B) при 4 ° С, супернатант видаляли і осад ще раз екстрагували тим же методом після додавання буфера Соренсена. Два супернатанти об'єднували і зберігали при 4 ° С до завершення подальших етапів екстракції. 33

Матеріали та методи Комплекси антитіл осаджуються. Після центрифугування 60 мкл надбудови видаляли і переносили в нову пробірку. Після додавання до цих пробірок 10 мкл агарози IgA проти людини в 40 мкл буфера TBT інкубацію проводили знову при 4 ° С протягом години під час струшування. Далі послідували етапи промивання, описані в 3.2.5 для всіх пробірок (Білок-G-сефароза та IgA-агароза), та вимірювання в γ-лічильнику. й 3.3 Статистика Оцінка сукупного ризику діабету та частоти діабету в моделі NOD проводилася за допомогою аналізів виживання. Тест log-rank був використаний для порівняння різних груп у моделі NOD. Порівняння балів інсуліну та поширеності антитіл між групами в моделі NOD проводили за допомогою непараметричного U-тесту Манна-Уітні. Кореляцію між відносним зв'язуванням ІАА з курячим інсуліном та спорідненістю ІАА визначали за допомогою кореляції Спірмена. Спорідненість між окремими групами порівнювали за допомогою U-критерію Манна-Уітні. У всіх аналізах значення р