Ін’єкція інсуліну та екстракція гемолімфи для вимірювання чутливості до інсуліну у дорослих дрозофіл

Резюме

Консервовані шляхи передачі інсуліну, виявлені у плодової мухи Drosophila melanogaster, роблять цей організм потенційним інструментом для моделювання метаболічних захворювань, таких як діабет II типу. З цією метою важливо встановити фізіологічні тести для ефективного вимірювання системного впливу інсуліну на периферичну глюкозу, доступну у дорослої мухи.

Анотація

Протокол

1. Інсулін, що робить розчин

  1. Готують свіжий бичачий інсулін, розчиняючи інсулін у PBS до досягнення концентрації 0,01 мг/мл. Під час ін’єкції розчини інсуліну/PBS та контрольний PBS повинні зберігатися на льоду. Ці розчини не слід готувати з 0,5% (об/об) FD&C Blue. 1 харчовий барвник.

2. Підготовка голки та встановлення ін’єкцій

  1. Для експериментів з ін’єкцією використовують жіночих мух віком 10 днів. Зберіть мух протягом 24 годин після вилуплення. Знеболіть мух зволоженим CO 2 на газовій прокладці, відсортуйте самців і помістіть самок-мух у флакони зі стандартною або лікувальною дієтою. Тримайте самок-мух на експериментальних дієтах протягом 10 днів.
  2. На десятий день після вилуплення та відокремлення на експериментальних дієтах мух перекладають зі своїх флаконів, що містять їжу, у флакони з 5-міліметровою пробкою, що містить 2% агару, і голодують їх протягом 12-16 год.
  3. Перенесіть голодні ампули з мухами з 10% просоченими глюкозою фільтрами за 1 годину до ін’єкції інсуліну.
  4. Коротко знеболіть мух зволоженим CO 2 після подачі глюкози, а потім знерухоміть їх холодно на льоду.

  1. Візьміться за холодно знерухомлену муху дрібними щипцями та тримайте кінчик голки близько, щоб кінчик знаходився поруч із передньою ділянкою лівої частини грудної клітки мухи. Підведіть у фокус під стереомікроскопом і кінчик голки, і грудну клітку мухи.
  2. Перемістіть муху у напрямку до кінчика голки так, щоб кінчик голки торкався центру купівок лівої області прекутуми грудної клітки мухи (рис. 1). Після того, як муха правильно вирівняна і знаходиться на одній лінії з кінчиком голки, муха продовжує рух на голку так, щоб голка набивала на центр пресуктуми попереду.
  3. Подайте позитивний тиск, просуваючи поршень шприца за допомогою мікроінжектора за допомогою кнопки мікроманіпулятора, доки на час не введеться 0,1 мкл рідини. Потік рідини в мухомолі надає синій колір лівій стороні передньої грудної клітки. Іноді вам доводиться втягуватись і просуватись кілька разів, щоб послабити всі закупорювання голки і дозволити потоку.
  4. Дозвольте ін’єкційним мухам у флаконах з 2% агару протягом певних часових точок відновлюватися перед вилученням гемолімфи.

6. Визначення глюкози гемолімфи

  1. Видаліть зразки гемолімфи у лунки мікропланшетів із 100 мкл реагенту Infinity Glucose. Тримайте тарілку на льоду під час завантаження зразків гемолімфи.
  2. Зробіть стандартну криву, завантаживши окремо 1 мкл кожного розчину глюкози на 50 мм, 25 мм, 12,5 мм, 6,25 мм і 3,125 мм.
  3. Інкубуйте зразки при температурі 37 ° C протягом 10 хвилин.
  4. Виявляють поглинання при 340 нм.
  5. Враховуйте обсяг зібраної гемолімфи та визначайте концентрацію глюкози у зразку на основі стандартної кривої з відомими концентраціями глюкози.

7. Репрезентативні результати

Типовою відповіддю на толерантність до інсуліну є ін’єкції інсулінових мух, де через 15 хвилин після ін’єкції виявляється зниження рівня циркулюючої глюкози. Навпаки, така реакція не відбувається у мух, що вводяться PBS (рис. 3). Ця реакція на периферичну глюкозу, доступну під час ін’єкції інсуліну, продовжує розвиватися протягом 30 хвилин після ін’єкції. Ми регулярно витягуємо 0,2-0,5 мкл гемолімфи на 4-5 мух у кожній групі ін’єкцій. Три ін'єкційні групи включаються в кожен експеримент.

екстракція
ілюстрація 1. Ліва сторона грудної клітини дрозофіли, що показує місце введення голки (Змінено з Demerec, 1950) 7. Введіть голку через центр прекутуми на передній, задній частині лівої сторони грудної клітки.

екстракція
Малюнок 2. Вигляд спереду голови дрозофіли, що показує місце проколу для вилучення гемолімфи (модифіковано Demerec, 1950) 7. Прокол капсули головки дрібно подрібненим вольфрамовим зондом у центр капсули голови над птинінальним швом.

гемолімфи
Малюнок 3. Типовою реакцією толерантності до інсуліну, виявленою серед контрольних дорослих, є мухи. Мухам Control-w 1118 вводили бичачий інсулін (1 нг у PBS) або лише PBS. Потім мух у повторюваних групах вимірювали протягом 0, 15 або 30 хвилин і знову циркулювали рівні глюкози.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Методика, описана в цьому звіті, потенційно корисна в будь-якому дослідженні, яке вивчає фізіологічні процеси, що призводять до виявлених змін у складі гемолімфи дрозофіли. Поєднуючи таким чином ін’єкцію та збір гемолімфи, можна визначити негайні фізіологічно важливі ефекти конкретного експериментального лікування чи маніпуляції. Основною перевагою цієї методики «кровопускання» у збиранні гемолімфи порівняно з попередніми процедурами, що передбачали декапітацію 2, є те, що ця методика мінімізує забруднення зразків гемолімфи з хорошим вмістом. з’являються краплі гемолімфи, що випромінюються, тоді зразки повинні точно відображати стан рідин кровообігу in vivo.

Потенційно заплутаним фактором, проведеним в результаті експерименту з ін’єкціями за цією шкалою, є перше розведення загальної кількості циркуляційних рідин після ін’єкції. Це легко контролювати, але після введення такого ж обсягу PBS експериментальним мушкам або інсуліну у відповідні контролі віку та нормалізацію результатів. Для забезпечення відтворюваних показників циркулюючої глюкози якість крапель гемолімфи має першорядне значення. Для визначення глюкози слід реєструвати лише прозорі крапельки гемолімфи без перицеребральних жирових тіл або інших залишків тканин. Також слід зазначити, що до визначення відносної концентрації глюкози слід відібрати лише до 8 зразків. Ми помітили "дрейф" у показаннях OD 340, коли зразки гемолімфи залишали на льоду протягом тривалого періоду часу.

Наш протокол залишає багато місця для змін у наявному обладнанні. Налаштування знімача піпетки потрібно змінювати залежно від моделі та стану знімача. Ми виявили, що установки для виготовлення адекватних внутрішньоклітинних голкових електродних голок ідеально підходять для підшкірних голок. Крім того, хоча ми використовували тривісний мікроманіпулятор для підтримки положення голки під стереоскопом, цього також можна досягти за допомогою стійкої кільцевої підставки та затискної системи, якщо голка залишається у фіксованому положенні в процесі ін’єкції. Високий опір використаних голок зумовив необхідність розробки альтернативного методу визначення об'єму впорскуваної рідини як переміщення поршня шприца 1: 1, щоб не досягти зрушення обсягу. Ми розробили шкалу, яку можна було роздрукувати та сформувати на боці голки. Залежно від використовуваної системи, може знадобитися витіснити деяку кількість рідини з голки за межі голкотримача мікроінжектора, щоб рідина меніска могла бути вирівняна за градаціями за допомогою калібрувальної картки, прикріпленої збоку валу голки.

Нарешті, у нашому протоколі зазначено два обмеження цієї техніки. По-перше, дві людини, як правило, повинні координувати етапи ін'єкції та вилучення гемолімфи, щоб максимізувати кількість оброблених зразків. По-друге, варіації реакції толерантності до інсуліну іноді спостерігаються в межах одного і того ж генотипу. Ми вважаємо, що завдяки змінним реакціям окремі мухи можуть після іммобілізації льоду та відновлення на агарі. Тому достатню кількість зразків слід дослідити, перш ніж можна буде зробити надійні висновки.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.