Клітинна диференціація - людина - харчування - навколишнє середовище

Принцип колориметричного виявлення за допомогою р-нітрофенолу Метаболізм pNPP до жовтого p-нітрофенолу в мембранозв'язаних лужних фосфатазах живих клітин.

Аналіз р-нітрофенолфосфату (аналіз pNPP) був вперше використаний Engvall та співавт. (1980) і використовується для визначення ступеня диференціації між адгезивними та неадгезивними клітинами. pNPP - субстрат лужної фосфатази (AP). Після гідролізу фосфатних залишків фосфатазою утворюється п-нітрофенол у вигляді жовтого, розчинного кінцевого продукту. Після закінчення реакції додаванням розчину гідроксиду натрію інтенсивність забарвлення можна визначити колориметрично в зчитувачі ELISA при довжині хвилі 405 нм. Утворення жовтого продукту пропорційне активності лужної фосфатази.

диференціація

Верхнє ліве зображення.

Принцип флюометричного виявлення за допомогою флуоресцеїн-дифосфату (FDP)

Активність лужної фосфатази також можна визначити флюориметрично як міру для оцінки ступеня диференціації.
У цьому випадку замість колориметричного барвника p-NPP використовується флуорометричний барвник флуоресцеїн дифосфат. Лужна фосфатаза здатна вивільняти з цієї сполуки флуоресцеїн, який потім можна виміряти флуориметрично (напр., 485 нм/Ем 538 нм) у багатопластинчастому зчитувачі.

Пробне оцінювання

1. Визначення вмісту білка в зразку за допомогою Бредфордського аналізу
2. Виміряйте поглинання або флуоресценцію зразків
3. Розрахунок як мкМ p-NP або флуоресцеїну/хв/мг білка

Малюнок вгорі праворуч.

Витрати (колориметричний доказ)

Витрати (флуорометричний доказ)

Приклади застосування

Дослідження щодо регуляції подій диференціації в контексті клітинного та тканинного гомеостазу після добавки флавоноїдів або олігосахаридів (Kuntz et al. 2007 і 1999)