Розробка паралельного багатокомпонентного аналізу реакцій антиген-антитіло в

Розробка паралельного багатокомпонентного аналізу реакцій антиген-антитіло при допінг-аналізі Дисертація на здобуття наукового ступеня "доктор природних наук" (доктор реф. Нац.) У науковій дисципліні біохімія, поданій на математичний та природничий факультет Потсдамського університету Каєм Вундерліхом Потсдамом, 29 вересня 2014 р

розробка

Ця робота ліцензована на умовах ліцензійної угоди Creative Commons: Атрибуція Без комерційного використання Немає похідної роботи 4.0 Міжнародна. Щоб переглянути умови ліцензії, перейдіть за гіперпосиланням: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ Інтернет опубліковано на сервері публікацій Потсдамського університету: URN urn: nbn: de: kobv: 517-opus4-76869 http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76869

Життя - як велосипед. Треба рухатися вперед, щоб не втратити рівновагу. Альберт Ейнштейн

Зміст Перелік таблиць Перелік рисунків V VII 1. Мотивація 1 1.1. Допінг у соціальному та спортивному контексті. 1 1.2. Заборони на допінг та необхідність допінг-контролю 5 1.3. Можливості та перспективи тестування на допінг-контролі. 7 2. Основи 9 2.1. Термін допінг та класифікація класів речовин у списку WADA заборонені. 9 2.2. Аналітичні методи виявлення легуючих речовин. 12 2.2.1. Газова хроматографія/мас-спектрометрія як усталений аналітичний метод допінг-аналізу . 13 2.2.2. Методи виявлення на основі імуноаналізу для виявлення пептидних гормонів та факторів росту 15 2.2.3. Принцип дії антитіл та їх роль у імунологічних дослідженнях. 16 2.3. Пептидні гормони як кандидати на розробку багатопараметричного допінг-тесту. 19 2.3.1. Лютеїнізуючий гормон (ЛГ) та його роль як допінг-агента. 20 2.3.2. Хоріонічний гонадотропін людини (hcg-i) та його роль як допінг-агента. 23 2.3.3. Варіанти цих пептидних гормонів та фармакологічні граничні значення. 24 2.4. Технічна концепція. 25 І.

4.3. Експерименти на мікрочипах для визначення перехресної реакційної здатності . 60 4.3.1. Експерименти на мікрочипах з одночасним використанням різних антитіл для виявлення на еталонному матеріалі. 63 4.4. Визначте межу кількісного визначення пептидних гормонів на мікрочипах. 67 4.4.1. Серія концентрацій hcg-інтактного в 1 х буфері PBS 67 4.4.2. Серія концентрацій hcg-β в 1 х буфері PBS. 68 4.4.3. Серія концентрацій LH в 1 х буфері PBS. 69 4.5. Вимірювання реальних зразків на предметних стеклах та склі 70 4.6. Проведіть аналіз ефективності, щоб визначити D-SN та D-SP. 72 4.6.1. Визначення діагностичної чутливості та специфічності LH, hcg-інтактного та hcg-β. 72 4.7. Тест на стабільність зберігання мікрочипів з урахуванням результатів вимірювань. 77 4.7.1. Тест на стабільність зберігання протягом дванадцяти тижнів для виявлення інтактного ХГЧ. 77 4.7.2. Тест на стабільність зберігання протягом дванадцяти тижнів для виявлення hcg-β. 79 4.7.3. Тест на стабільність зберігання протягом дванадцяти тижнів для виявлення ЛГ. 80 5. Обговорення 83 6. Перспективи 93 7. Підсумок 95 Бібліографія 99 A. Додаток 111 A.1. Буфери та розчини. 111 A.1.1. Композиція гелю SDS для відділення та збору гелю 113 A.2. Столи. 114 А.3. Публікації. 126 А.3.1. Рецензовані публікації. 126

А.3.2. Лекції, а також постери та нерецензовані публікації. 127 А.4. Резюме. 128 А.5. День Подяки. 129 А.6. Законодавча декларація. 130

Перелік таблиць 3.1.1 Використані пристрої. 29 3.1.2. Використані витратні матеріали. 30 3.1.3 Використані хімічні речовини та розчини. 31 3.1.4 Антитіла. 32 3.1.5. Пептидні гормони та матеріал зразка. 33 3.1.6. Використано програмне забезпечення. 34 3.2.1. Навантаження гелем SDS-PAGE. 36 3.2.2 Налаштування тесту Вестерн-блот. 37 3.2.3 Експериментальна схема, перехресна реакційна здатність на мікрочипах. 3.2.4 Класифікація результатів вимірювань за допомогою матриці істинності 48 3.2.5 Розмір вибірки для визначення відтворюваності протягом дванадцяти тижнів. 51 4.1.1.Тест на перехресну реактивність моноклональних антитіл для захоплення.56 4.1.2.Тест на перехресну реактивність антитіл до поліклональної детекції. 57 4.2.1.Порівняння промивних розчинів на оброблених мікрочипах. 60 4.3.1 Тест на перехресну реакційну здатність з hcg-i на мікрочипах виявлення та вторинних антитіл у 1 х PBS. 61 4.3.2 Визначення ефектів матриці та перехресних реакцій у складних зразках. 65 4.5.1.Вимірювання реальних зразків на предметних стеклах із скла та полімеру 71 4.6.1.Ринові криві результатів аналізу продуктивності 130 зразків сироватки 73 4.6.2.Аналітична інтерпретація 130 зразків з однієї сліпої партії. 75 4.6.3 Оцінка вибіркового колективу з Інституту біохімії в Кельні. 4.7.1 Тест на стабільність зберігання мікрочипів для hcg-i протягом дванадцяти тижнів. 78 проти

4.7.2 Тест на стабільність зберігання мікрочипів для hcg-β протягом дванадцяти тижнів. 4.7.3 Тест на стійкість мікрочипів для ЛГ протягом дванадцяти тижнів 81 А1. Ключ зразка для 130 зразків сироватки для аналізу продуктивності. 114 А2. Тест перехресної реактивності на мікрочипах виявлення та вторинних антитіл при різних концентраціях hcg-i в 1 х PBS. 118 А3. Випробування перехресної реактивності на мікрочипах виявлення та вторинних антитіл при різних концентраціях hcg-i у еталонному матеріалі. 119 A4. Випробування перехресної реактивності на мікрочипах виявлення та вторинних антитіл у еталонному матеріалі. 120 A5. Визначення ефектів матриці та перехресних реакцій у складних зразках. 121 А6. Оцінка вибіркового колективу з Інституту біохімії в Кельні. 122 А7. Тест на стійкість мікрочипів для hcg-i протягом дванадцяти тижнів123 A8. Тест на стабільність мікрочипів для рівня hcg-β протягом дванадцяти тижнів. 124 А9. Тест на стійкість мікрочипів для ЛГ протягом дванадцяти тижнів 125

Перелік рисунків 2.1. Список заборонених речовин 2013 року, проведений WADA. 11 2.2. Аналіз допінг-зразків. 13 2.3. Схема потоку робіт. 27 3.1. Точковий малюнок мікрочипів. 40 4.1. SDS-PAGE для перевірки концентрації білка. 54 4.2. Короткий зміст тесту на перехресну реакційну здатність мікрочипів на скляних предметних стеклах, модифікованих GLYMO 66 4.3. Серія концентрацій hcg хоріонічного гонадотропіну людини в 1 х PBS. 67 4.4. Серія концентрацій hcg-β в 1 х буфері PBS. 68 4.5. Серія концентрацій LH в 1 х буфері PBS. 69 4.6. Серія концентрацій ЛГ у повній сироватці. 70 VII

2.1. Термін допінг та класифікація класів речовин у Списку заборонених WADA Рис. 2.1.: Список заборонених речовин WADA 2013 (скорочено). Класи речовин (і приклади), перелічені тут, заборонені в будь-який час під час та поза змаганнями. Пептидні гормони, перелічені в пункті S 2.2 (червоний ящик): хоріонічний гонадотропін (ХГ) та лютеїнізуючий гормон (ЛГ), заборонені лише чоловікам, оскільки вони мають регулюючу дію на каскад тестостерону. Обидва гормони визначають із сечі за допомогою імуноаналізів. [ВАДА, 2012] 11

3. Матеріальні та експериментальні роботи та біоактивність 14000 ОД/мг. Це відповідає біоактивності 14000 мкм/мкл у вихідному розчині. Β-субодиниця hcg доступна у вигляді основного розчину з концентрацією 0,1 мг/мл. Виробник не зазначає жодної біоактивності для цього. Відповідно до [Stenman et al., 2006], біоактивність для hcg-β дається як 1 ОД/мкг. Відповідно, вихідний розчин hcg-β містить 100 ОД/мл або 100 мкМ/мкл. LH був присутній у концентрації 0,1 мг/мл. Таблиця 3.2.3.: Схема випробувань для виявлення можливої ​​перехресної реактивності компонентів аналізу. Як матриці зразків, стандартну сироватку/кров та контрольну сироватку/кров також тестували за тією ж схемою, аналогічно 1-кратному буферу PBS. Хрестики означають комбінації пептидних гормонів та антитіл для виявлення. антитіла до поліклонального виявлення проти пептидного гормону hcg-α hcg-β LH CRP - - - - x - - - - - x - - - x - - - - x - - - x - - - 100 мкм/мл LH - x - - - - x - - - - x - - - - x - - - 500 мкг/мл hcg - x - - - - x - - - - x - - - - x - - - 36 mu/ml hcg-β - x - - - - х - - - - х 42