Вплив чаю катехіну епігалокатехінгалат на енергетичний метаболізм миші - PDF безкоштовно

Німецький інститут досліджень харчування (DIfE) Потсдам - Ребрюке, робоча група кафедри фармакології Фізіологія енергетичного метаболізму Вплив чайного катехіну епігалокатехінгалат на енергетичний метаболізм миші Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора наук (доктор рен. Наук) на факультеті математики та природничих наук Потсдамського університету від Dipl .-Харчова наука Майка Фрідріх народилася 1 листопада 1978 року, Магдебург, Потсдам, лютий 2010 року

Ця робота ліцензована відповідно до ліцензійної угоди Creative Commons: Атрибуція Без комерційного використання Немає адаптації 3.0 Німеччина Щоб переглянути умови ліцензії, перейдіть за гіперпосиланням: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/Опубліковано в Інтернеті на сервері публікацій Потсдамського університету: URL http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2010/4815/ urn urn: nbn: de: kobv: 517-opus-48159 http: // nbn-Resolution .org/urn: nbn: de: kobv: 517-opus-48159

mrna MRP NaOH NEFA ЯМР pa PAS PC PCR PDB PDE PDHx PEPCK PIG-B PK месенджер Рибонуклеїнова кислота Мультипрепарат стійкість білок гідроксид натрію неестерифіковані жирні кислоти неестерифіковані жирні кислоти Ядерний магнітний резонанс постабсорбтив Періодична кислота Шифф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайф Шфайффай Піруват-дегідрогеназний комплекс Фосфоенолпіруват-карбоксилаза Фенол-ізоаміловий спирт-гуанідіній ізотіоціанат-меркаптоетанол Піруват-кіназа PLA 2 Фосфоліпаза A 2 Плін Периліпін PO Пальмітат-окиснення pp постпрандиальний реактивний час кисень-реактивний час реактивний час кисень-реактивний реактивний час кисень Карбоксилаза SD Стандартна дієта SGLT1 Натрієзалежний транспортер глюкози 1 SO окислення субстрату StK Метаболічна клітка TG Тригліцерид TM суха речовина UCP роз’єднання білка VO 2 Споживання кисню WAT біла жирова тканина ВООЗ Всесвітня організація охорони здоров’я VII

Вступ Поліфеноли - це флавоноїди, які в свою чергу поділяються на флаваноли та катехіни. Катехіни в зеленому чаї складають до 30% сухої речовини. Їх диференціюють наступним чином: (рис. 1-2): епікатехін (ЕК), епікатехін галлат (ЕКГ), епігалокатехін (ЕГК) та епігалокатехін галлат (ЕГКГ). Структурні відмінності виникають у кількості гідроксильних груп та у присутності галоїльної групи. З часткою до 50% від загального вмісту катехіну, EGCG є переважним катехіном у зеленому чаї. Крім катехінів, зелений чай містить білки (15%), клітковину (26%), інші вуглеводи (7%), ліпіди (7%), мінерали (5%), амінокислоти (4%) та пігменти (2%) (Кабрера та ін., 2006). Рис. 1-2: Хімічна структура основних компонентів зеленого чаю (Koo & Noh, 2007) Іншим компонентом зеленого чаю є кофеїн, який складає приблизно 3 6% (Yang & Landau, 2000). Чашка зеленого чаю містить від 20 до 100 мг EGCG та 20 кофеїну 40 мг (Stangl et al., 2006; Khokhar & Magnusdottir, 2002). Різні чайні катехіни мають різну біологічну активність, причому EGCG демонструє найвищу активність (Chen et al., 1997). Серед чайних катехінів він має найбільшу кількість гідроксильних груп на трьох вуглецевих кільцях, які важливі для утворення сполук водню. Галлоїльна група, що міститься в молекулі EGCG, може також взаємодіяти з іншими молекулами, наприклад B. Введіть радикали (Ляо, 2001). 14-е

У вступі був особливий інтерес до дослідження поліфенолу EGCG, який переважно міститься в зеленому чаї. Багато ефектів, описаних у літературі, спостерігалися після тривалого використання. Неясно, чи зміни в довгострокових дослідженнях спричинені безпосередньо ЕГКГ чи опосередковано в результаті зменшення жиру. Тому для досліджень, проведених тут, було обрано коротко- чи середньострокову тривалість заявки, під час якої зміни у складі тіла ще не були чітко проявлені. Метою цієї роботи було детально дослідити вплив поліфенолу чаю EGCG на енергію та метаболізм субстрату після короткочасного та середньострокового застосування. В якості дослідницької моделі була обрана миша, оскільки вона та люди досить схожі з точки зору біодоступності EGCG. Метою було з'ясувати, який вплив EGCG чинить на різні фізіологічні параметри в моделі миші після короткочасного та середньострокового застосування. Метаболізм енергії та жиру після коротко- та середньострокового застосування слід досліджувати з урахуванням енергетичного балансу та на молекулярному рівні, щоб виявити можливі механізми. 23

Матеріал та методи Таблиця 2-2: Джерела поживних речовин напівсинтетичних дієт з високим вмістом жиру Інгредієнти [г/100 г] Експеримент 3 (див. 2.2.3.3) Експеримент 4 (див. 2.2.3.4) Казеїн 1 20 18 Пшеничний крохмаль 2 40 43 Сахароза 3 5 5 Пальмовий жир 4 18 Лляна олія 5 1 Сафлорова олія 6 1 Кукурудзяна олія 7 17 Целюлоза 8 11 7 Мінеральна суміш 9 5 5 Вітамінна суміш 10 2 2 Вода, мл 30 30 Вміст енергії [кДж/г] 19,9 21,3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Постійний молочний завод Peiting GmbH, Landshut (86% сировинного білка) Kröner GmbH, Ibbenbüren/Westfahlen Nordzucker GmbH, Uelzen OTHÜNA, Ostthüringer Nahrungsmittelwerk Gera GmbH, Gera LARU Langensiep & Ruckebier GmbH, Bottrop Kunella Feinkost GmbH, Cottbus Mazoten Unilever Hamburg GmbH. GmbH, Розенберг Мінерально-мікроелемент Премікс С1000 на 100 г: приблизно 930 мг; Р, 730 мг; Mg, 80 мг; Na, 440 мг; К, 710 мг; S, 170 мг; Cl, 360 мг; Fe, 20 мг; Mn, 10 мг; Zn, 3 мг; Cu, 800 мг; J, 40 мг; F, 400 мг; Se, 20 мг; Co, 10 мг (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) Вітамінний премікс С1000 на 100 г: А, 0,45 мг; Холекальциферол, 1,13 мг; К 3, 1 мг; Тіамін, 2 мг; Рибофлавін, 2 мг; В-6, 1,5 мг; В-12, 3 мг; Ніацин, 5 мг; Пантотенова кислота, 5 мг, фолієва кислота, 1 мг; Біотин, 20 мг; Холін хлорид, 100 мг; п-амінобензойна кислота, 10 мг; Інозитол, 10 мг; Е, 16,4 мг (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) 26

Матеріал та методи 2.2.3 Структура випробувань Для того, щоб дослідити вплив EGCG, було проведено декілька випробувань на тваринах з різними схемами дослідження. 2.2.3.1 Експеримент 1: Дослідження коротко- та середньострокового впливу EGCG на параметри енергетичного обміну У цьому експерименті слід дослідити коротко- та середньострокові ефекти застосування EGCG на параметри енергетичного обміну, особливо енергетичного обміну. Для цього було проведено два часткові випробування (рис. 2-2). Рис. 2-2: Хід досліджень на тваринах, проведених для дослідження впливу EGCG на параметри енергетичного метаболізму у мишей після короткочасного (1А) та середньострокового (1В) застосування ЯМР Визначення складу тіла за допомогою спектроскопії ЯМР (див. 2.2.5) ITK Непряма калориметрія тварин; Визначення параметрів енергообігу (див. 2.2.6) Окислення субстрату SO за допомогою стабільних ізотопів (див. 2.2.7.1) Вбивство клітини метаболізму StK t 27

Матеріал та методи Рис. 2-4: накопичення 13 C у вибраних органах та тканинах, а також видихуване повітря у мишей після переходу зі стандартної дієти (SD) на дієту з високим вмістом жиру 13 C (HFD); DOB = дельта над базовим тестом EGCG Попереднє тестування призвело до періоду годування тижнем, щоб визначити вміст 13 C залежно від застосування EGCG. Тут також мишей перевели з SD на напівсинтетичний HFD, який містив кукурудзяну олію як єдине джерело жиру (рис. 2-5). Основи описані в пункті 2.2.7.2. EGCG вводили з кормом (групи: вихідна група (SD), контроль, 0,25%, 0,50% EGCG (HFD), n = 8). Рис. 2-5: Програма випробувань для дослідження включення 13 С дієтично маркованих тригліцеридів у мишей ЯМР-визначення складу тіла за допомогою ЯМР-спектроскопії (див. 2.2.5) Зразок дихального газу для визначення збагачення 13 С за допомогою IRMS (див. 2.2.7.1) t вбити 30

30 л/год. Для підтримання постійної температури навколишнього середовища (22 С) клітини для дихання розміщувались в кліматичних шафах (Vötsch Industrietechnik, Reiskirchen-Lindenstruth). Частка споживання O 2 (VO 2) та вироблення CO 2 (VCO 2) визначали для кожної тварини через 6-хвилинний інтервал. Відповідно до рівняння 2-2 (Френц, 1999). Мишам давали їжу о 16:00, щоб вивчити вплив EGCG як в умовах поглинання, так і після прийому їжі. У короткостроковому дослідженні годування поєднували з пероральним застосуванням ЕГКГ. 36

Матеріал і методи Пластину піпетують, додають 150 мкл ферментного реагенту (RGT), змішують і центрифугують. Після часу інкубації 10 хвилин при кімнатній температурі відмирання зразків та стандарту вимірювали щодо заготовки реагенту (води) при 500 нм (Power Wave 340, BioTek Instruments GmbH, Бад-Фрідріхсхалл). Концентрацію холестерину в зразках плазми розраховували за допомогою рівняння лінійної регресії стандартної серії (рівняння 2-19). ymxn (рівняння 2-19) yxmn нахил концентрації екстинкції прямої лінії перетину з віссю y 2.5.1.2 Принцип вільних жирних кислот Кількісне визначення вільних жирних кислот у плазмі проводилось за допомогою тесту NEFA-C (Wako Chemicals GmbH, Neuss) . Принцип реакції показаний у наступних рівняннях (рівняння 2-20 - рівняння 2-22). R COOH Acyl CoA Synthetase ATP CoA SH Acyl CoA AMP PP i (екв. 2-20) Acyl CoA O Acyl CoA оксидаза 2 2,3 транс Ендол CoA H2O2 (екв. 2-21) Пероксидаза 2 H2 O2 4 Амінофена зона MEHA Хінонімін 4 H2O (рівняння 2-22) R-COOH ATP CoA-SH AMP PP i жирні кислоти аденозинтрифосфат кофермент A аденозинмонофосфат фосфорна кислота 50

Матеріал та методи ΔE порожній (E2 E1) порожній 2 (E3 E2) порожній (Eq. 2-29) ΔE зразок (E2 E1) зразок 2 (E3 E2) зразок (екв. 2-30) Вимірювання вимирання (E1-E3), визначені для зразків та значень порожніх значень (рівняння 2-29 - рівняння 2-30). Це використовується для обчислення різниці між величиною вибірки та порожнім значенням (рівняння 2-31). ΔE ΔE зразка ΔE порожнє значення (рівняння 2-31) Потім розрахували концентрацію, використовуючи товщину шару згідно з наступним рівнянням (рівняння 2-32): c β HB V MW β HB ε dv 1000 ΔE g/l (рівняння 2 -32) V кінцевий об'єм (мл) Молекулярна маса МВт -HB (104,1 г/моль) коефіцієнт екстинкції формазану при 492 нм (19,9 л моль -1 см -1) d товщина шару (1 см) v об'єм проби (мл) розрахункові концентрації триразових значень усереднювались і враховувалось розведення зразків плазми 1: 2. 2.5.2 Визначення тригліцеридів у печінці Для визначення вмісту тригліцеридів у печінці тригліцериди спочатку екстрагували НВ-буфером. Потім витягнуті тригліцериди можна було визначити за допомогою набору для визначення тригліцеридів (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen). 55

Матеріал і методи TE буфер Тріс-HCl EDTA в автоклаві, тобто 2 O регулюють рН 8,0, автоклав 10 мм 1 мм 10xMOPS MOPS ацетат натрію EDTA pH 5,5 7,0; автоклав (зміна кольору на жовтий) 200 мм 50 мм 10 мм 1xMOPS - буфер для електрофорезу 10xMOPS ad 1 л з автоклавом dh 2 O 100 мл денатураційний буфер 10xMOPS 100 мкл 37% формальдегіду 175 мкл 50% формаміду 500 мкл ad 1 мл з автоклавованим dh 2 O запущеним буфером гліцерину 500 мкл автоклавного dh 2 O 400 мкл 10xMOPS 100 мкл насадки шпателя бромофенол синій розчин броміду етидію 0,1% броміду етидію 50 мкл автоклаву dh 2 O 950 мкл 2.6.4 Очищення РНК з використанням розщеплення ДНКази З метою мінімізації можливого забруднення РНК геномною ДНК Екстракти РНК, очищені набором без ДНК TURBO (Ambion/Applied Biosystems, Дармштадт). Для цього приблизно 10 мкл РНК (між 5-40 мкг РНК) змішували з 7 мкл води, обробленої DEPC, 2 мкл буфера Turbo DNase і 1 мкл DNase протягом 30 хвилин при 37 C в термоциклері (Peltier Thermal Cycler PTC-200, MJ Research Inc., Уолтем, Массачусетс, США). Потім до 65 додавали 2 мкл реагенту для інактивації ДНКази

Матеріал і методи Таблиця 2-12: кількість кдн серії розведення для визначення концентрації ефективності праймера 1 0,05 концентрації 2 0,20 концентрації 3 1 концентрації 4 5 концентрації 5 20 концентрації 6 50 кдн кількості [нг] Графічне зображення Логарифмічні початкові концентрації рядів розведення (вісь х) щодо значень КТ (вісь у) призвели до лінії регресії, збільшення якої використовувалося для розрахунку ефективності (рівняння 2-40, Ваерман та ін., 2004). Ефективність, як правило, становила 85-100%. E 10 1/m 1 (рівняння 2-40) Відносна кількісна оцінка експресії гена мала місце після нормалізації до еталонного гена (тут: 18SrRNA, рівняння 2-41). ΔC T C T ('цільовий ген) C T (18SrRNA) (рівняння 2-41) Потім розраховане значення C T віднімали з вигаданого значення 36 (рівняння 2-42). Передбачається, що при значенні C T 36 ампліфікація 18SrRNA не відбувається, оскільки умови реакції (наприклад, концентрації праймерів, концентрація MgCl 2) вже не є оптимальними в кінці ПЛР. ΔΔC 36 T ΔC T (рівняння 2-42) Експоненціальні значення C T були перетворені в лінійну форму шляхом підняття в ступінь бази 2 (рівняння 2-43). Відносна експресія гена 2 C T (рівняння 2-43) 72