Вплив тучних клітин на загоєння шкірних ран шкірних ран Pseudomonas aeruginosa
Від Клініки дерматології, венерології та алергології медичного факультету Charité Universitätsmedizin Berlin ДИСЕРТАЦІЯ Вплив тучних клітин на загоєння шкірних ран шкірних ран Pseudomonas aeruginosa для здобуття вченого ступеня Doctor medicinae (Dr. med.) Представлено на медичному факультеті Charité Universitätsmedizin Berlin. Tröltzsch з Карла-Маркса-Штадта/нині Хемніц Дата доктора наук: 04.09.2015-1 -
Присвячується моїм батькам Рецензент: 1. 2. 3. Дата доктора. - 2 -
Зміст Резюме. Анотація. Постановка цілей. 1. Вступ. 1 1.1. Основи біології тучних клітин. 1 1.1.1. Вступ. 1 1.1.2. Характеристика тучних клітин. 2 1.1.3. Структура розподілу та неоднорідність. 3 1.1.4. Виникнення та розвиток. 5 1.1.5. Фізіологія та функції тучних клітин. 7 1.1.6. Імунологічні компетенції тучної клітини. 11 1.2. Роль тучних клітин у природному імунітеті до бактерій. 12 1.2.1. Загальні. 12 1.2.2. Бактерія синьогнійна паличка. 14 1.2.3. Антимікробні пептиди та протеази MZ, а також їх роль у опосередкованому MZ імунному захисті. 15 1.3. Загоєння шкірних ран. 16 1.3.1. Огляд. 16 1.3.2. Фази та механізми загоєння ран. 17 1.3.3. Загоєння ран та тучних клітин - стан досліджень. 20 2. Матеріал і методи. 22 2.1. Тварини. 22 2.1.1. Kit W/Kit W-v - модель миші. 22 2.1.2. Відновлення. 23 2.2. Експеримент із загоєння ран на мишах дикого типу та з дефіцитом MZ. 23 2.2.1. Знеболення. 23 2.2.2. Поранення, зараження та боротьба. 23 iii
2.2.3. Вимірювання ран. 24 2.2.4. Гістологія. 25 2.3. Бактеріальне навантаження на рану. 26 2.4. Клітини. 27 2.4.1. Отримання та культивування культивованих MZ (BMCMC), отриманих з кісткового мозку. 27 2.4.2. Отримання клітин очеревинної щогли (ПМК). 28 2.4.3. Магнітне розділення комірок (MACS). 28 2.4.4. Вирощування PCMC. 28 2.4.5. Аналіз FACS. 29 2.5. Вирощування культури синьогнійної палички. 30 2.6. β - аналіз гексозамінідази. 30 2.7. Визначення рівня виживання бактерій. 31 2.8. Цитоспін. 32 2.9. Кількісна ПЛР у реальному часі (q-rt-pcr). 32 2.9.1. Буквар. 32 2.9.2. Стимуляція PCMC. 34 2.9.3. Ізоляція РНК. 34 2.9.4. Визначення чистоти та концентрації РНК. 35 2.9.5. Перепишіть у кдн. 35 2.9.6. Процедура ПЛР за допомогою LightCycler. 36 2.10. Статистичний аналіз. 37 3. Результати. 39 3.1. Курс загоєння ран у MZ-дефіцитних мишей Kit W/Kit W-v після зараження бактерією Pseudomonas aeruginosa затримується. 39 3.2. Нормальне загоєння ран, інфікованих синьогнійною паличкою, залежить від тучних клітин. 43 3.3. Гістологічне підтвердження успішного відновлення MZ-дефіцитного набору W/Kit W-v - мишей з BMCMC. 46 3.4. Тварини з ранами, зараженими PA, не мають системних ознак зараження. 49 iv
3.5. MZ зменшують бактеріальне навантаження на рани, інфіковані синьогнійною паличкою. 51 3.6. Бактерія синьогнійна паличка та її компоненти не призводять до дегрануляції культивованих перитонеальних тучних клітин (PCMCs). 53 3.7. MZ знижують рівень виживання бактерії синьогнійної палички в кокультурі. 55 3.8. Виявлення експресії селекції антимікробних пептидів та протеаз, що секретуються MZ після стимуляції LPS і PA. 57 3.9. Синьогнійна паличка та LPS незначно змінюють експресію MZ-специфічних протеаз та антимікробних пептидів через 4 та 24 години стимуляції. 59 3.10. Культивовані перитонеальні тучні клітини як модель для тучних клітин шкіри. 61 4. Обговорення. 64 5. Бібліографія. 77 6. Свідчення. 99 7. Біографія. 100 8. Подяки. 101 до н
Завдання in vivo: 1. Презентація зміненої тенденції загоєння ран мишей Kit дикого типу +/+ - та дефіциту MZ Kit/Kit Wv після зараження бактерією Pseudomonas aeruginosa (рівно) 2. Докази залежності MZ бактеріальних порушень загоєння ран шляхом відновлення MZ дефіцитні миші з використанням BMCMC 3. Порівняльне визначення бактеріального навантаження на рани мишей Kit +/+ - та Kit W/Kit Wv - після 24 годин зараження ПА in vitro: 4. Дослідження активації МЗ ПА, а також за окремими компонентами цієї бактерії 5. Кількісне виявлення прямого елімінування ПА MZ у спільній культурі 6. Ідентифікація секретованих антимікробних пептидів або протеаз MZ після бактеріальної стимуляції та кількісна оцінка їх експресії за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі viii
Таблиця 1 Властивості слизової оболонки миші та тучних клітин сполучної тканини (Galli, 1990) Слизова оболонка MZ (MMC) Сполучна тканина MZ (CTMC) Поява Бронхіальний епітелій, слизова оболонка кишечника Шкіра, легені, очеревина Тривалість життя Близько 40 днів Кілька місяців до років Ультраструктура гранул Дрібна, гетерогенна електрон-щільна Великий, однорідний, електронно-щільний розвиток, що залежить від Т-клітин Так Ні Найвидатніший внутрішньогранулярний протеоглікан Хондроїтин сульфат Гепарин Може бути забарвлений альціановим синім Альціановим синім, берберином сульфатом, сафраніном Вміст гістаміну в гранулах Низький високий Вміст серотоніну в гранулах Низька варіабельна присутність високої спорідненості Ні/Висока афінність Ні 80 Так, серед популяцій тучних клітин людини розрізняють схему експресії триптази та хімази, двох добре відомих протеаз тучних клітин. Триптазо- та хімаза-позитивні клітини мешкають у шкірі, тоді як триптаза-позитивні тучні клітини домінують у легенях (Irani et al., 1986; Miller and Schwartz, 1989; Welle et al., 1997). - 4-й -
ПЛР оцінювали за допомогою відносної кількісної оцінки на основі β-актину як гена ведення домашнього господарства, за допомогою якого співвідношення стимульованої та нестимульованої проби (співвідношення) можна було визначити, використовуючи наступні формули: Співвідношення = 2 -ΔΔCt ΔΔCt = ΔCt (стимульоване) - ΔCt ( нестимульований) ΔCt = Ct (ген-мішень) Ct (ген ведення домашнього господарства). Значення Ct (поріг циклу) описує цикл ПЛР, при якому флуоресценція значно зростає вперше. 2.10 Статистичний аналіз Статистичну оцінку результатів цієї роботи проводили за допомогою наступного методу: Розрахунок середнього значення M: M 1 nnxii 1 n Кількість виміряних значень xi Значення виміряного значення i Стандартне відхилення SD середнього значення: SD 1 n 1 nxi M i 1 2 Стандартна помилка SEM des Середнє значення: SD SEM n - 37 -
Всі набори даних були проаналізовані на значущість за допомогою двостороннього t-критерію Стьюдента для несполучених зразків: Розрахунок значення: t M 2 1 1 1 SD n M 2 SD n 2 2 2 M 1: середнє значення вибірки 1 M 2: середнє значення вибірки 2 SD 1 Стандартне відхилення середніх значень популяції 1 SD 2 Стандартне відхилення середніх значень популяції 2 n 1 Кількість виміряних значень у вибірці 1 n 2 Кількість виміряних значень у вибірці 2 Значення ймовірності ([p]) p 0,05 як незначне переглянуто. Всі дані були представлені як середнє значення ± SE. Статистичний аналіз проводили за допомогою комп'ютерного програмного забезпечення Statview (Statview для Windows, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). - 38 -
Рисунок 1a Kit +/+ (не інфікований) 1,5 см 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Kit +/+ (заражений) 1,5 cm 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Рисунок 1b Kit W/Kit Wv (не заражений) 1,5 1,5 см см 0 год 6 год 12 год День1 День2 День3 День4 День5 День6 День7 День8 День9 Комплект Ж/комплект Вт (інфікований) 1,5 1,5 см см 0год 6год 12год День1 День2 День3 День4 День5 День6 День7 День8 День9 Рисунок 1 a/b: Зона миші з дефіцитом MZ, інфікованої синьогнійною паличкою, збільшена. Ці рани інфікували 10 мкл суспензії синьогнійної палички (PA) у концентрації 6,5 × 10 5 PA/10 мкл або 10 мкл PBS як негативний контроль та фотографували через описані інтервали часу. Репрезентативні зображення закриття рани однієї тварини в зазначений час показані з однаковим масштабом 1,5 см. Малюнок 1a Набір дикого типу +/+ - миші, Малюнок 1b Набір з дефіцитом MZ W/Kit W-v - миші. - 41 -
* ** ** * * * * * * Рисунок 2: Процес загоєння ран ран, інфікованих синьогнійною паличкою, затримується у MZ-дефіцитних Kit W/Kit W-v - мишей. Інфіковані миші Kit +/+ (n = 9), інфіковані MZ-дефіцитні комплекти W/Kit Wv миші (n = 6) та відповідні контролі (n = 10 або n = 6) були індивідуально оброблені ранами в області спини хвоста Зцілення задокументовано. Ілюстрація показує процес загоєння ран протягом 9 днів, побудований як відсоток площі поранення ран, пробитих на день 0. Дані зведені за результатами 2 незалежних експериментів, де n = 6-10 тварин на групу, і подано як середнє значення ± SEM; * = p 1 відповідає, наприклад, триптазі 1 під LPS (2,9 рази ± 1,3 SEM) та PA (2,2 рази ± 0,3 SEM), катепсину G під LPS (2,2- разів ± 1,0 SEM) та PA (1,4 рази ± 0,1 SEM), MCPT8 під LPS (2,6 рази ± 0,8 SEM) та PA (1,6 рази ± 0,2 SEM ), MCPT9 під LPS (3,1 рази ± 1,5 SEM), а також Granzym B під LPS (2,0 рази ± 0,6 SEM) та під PA (2,9 рази ± 1,5 SEM) . На відміну від цього, експресія MCPT9 була знижена за допомогою стимуляції PA (0,7-кратне ± 0,1 SEM). Зниження регуляції певних білків та протеаз спричинене значеннями